Medisinsk mikrobiologi

Program kursdag 1 og kursdag 2 i 3. semester

Normalflora, sårinfeksjoner og stafylokokker

Tidsramme for kursdag 1
30 min.   Innledning.
30 min.   Hjørnesamling.  Tilrettelegging.
45 min.   Praktisk arbeid.

Tidsramme for kursdag 2
30 min.   Innledning.
60 min.   Praktisk arbeid.
15 min.   Hjørnesamling.

Læremål
Diagnostisk tankegang ved infeksjonssykdommer.
Normalflora, særlig på huden.
Arbeidsregler ved praktisk laboratoriearbeid.
Gram-farging og mikroskopi av bakterier.
Utsæd av bakterieprøver, avlesning av dyrkningsresultat.
Stafylokokkinfeksjoner og egenskaper hos stafylokokker.
Antibiotika: betalaktamantibiotika (penicilliner og cephalosporiner),- virkningsmåter og resistensmekanismer.
Smittekjeden.

Bakgrunnsstoff
Om identifisering og klassifisering av mikroorganismer.
Bakteriecellens oppbygning og metabolisme.
Samspill mellom bakterier og vert med spesiell vekt på bakteriers virulensfaktorer, dvs. faktorer som bidrar i utvikling av infeksjonssykdom.
Om hudens og tarmens normalflora.
Mekanismer for smittespredning.
Om slekten Staphylococcus (agensegenskaper og sykdomsbilder).
Betalaktamantibiotika.

Praktisk arbeid
Det praktiske kursarbeidet er konsentrert om 3 oppgaver som påbegynnes 1. kursdag og avsluttes 2. kursdag.
Oppgavene er:
*  undersøkelse av puss fra operasjonssår (abscess)
*  koagulasetest av stafylokokker
*  isolasjon av normalflora fra egen hud/negler

Arbeidsplan for 1. kursdag.

Tidsramme
30 min.  Innledning
30 min.  Hjørnesamling.  Tilrettelegging
45 min.  Praktisk arbeid
               Mikroskopi (Gram-farging) og dyrkning av puss. Utføre koagulasereaksjon 
               på stafylokokker.
               Dyrkning av prøve fra egen hud/negler.

Sykehistorie

En 55 år gammel mann ble innlagt på kirurgisk avdeling for kreft i tykktarmen (cancer coli). Pasienten ble operert og svulsten ble fjernet ved at ca. halvparten av tykktarmen med svulsten i ble skåret vekk (hemicolectomi). Det femte postoperative døgnet fikk pasienten bankende smerter i operasjonssåret på magen (abdomen) og temperaturstigning til 38,5C. Såret ble åpnet og det ble funnet en pussansamling (abscess) som kunne dreneres.
Puss ble sendt til mikrobiologisk laboratorium for direkte mikroskopi og dyrkning. Deretter startet man behandling med cefalotin 1 g x 4 daglig. Cefalotin er et antibiotikum som hører hjemme i gruppen betalaktam-antibiotika. 

Klinisk diagnose:………………………………………………………………………

Praktisk oppgave nr. 1

Undersøkelse av puss fra operasjonssår (abscess) ved mikroskopi (Gram-farging) og dyrkning.

Dere har fått utlevert et glassrør med puss fra abscessen, merket "puss"..Dette pusset skal dere undersøke ved direkte mikroskopi og ved dyrkning på faste medier.
For å spare tid, er det lagt ut ferdig, fikserte preparater, tatt direkte fra pusset. Det skal farges med Grams fargeteknikk.

Mikroskopi
For å se bakteriene i mikroskopet anvender vi fargemetoder. Den viktigste fargemetoden er Gram-farging, oppkalt etter dansken Christian Gram som oppfant metoden i slutten av forrige århundre. Dette er en differensialfarging som utføres i flere trinn med forskjellige fargevæsker. Ved denne metoden blir bakteriene enten røde eller blå. Denne forskjellen i fargbarhet avspeiler en fundamental forskjell i oppbygningen av celleveggen og i en rekke andre grunnleggende egenskaper. Noen bakterier blir blåfiolette: Gram-positive og noen blir røde (rosa): Gram-negative.

For å lage preparatet trenger du en bakteriologisk "øse" og et objektglass, begge deler finnes i skuffen, dessuten gassflamme fra Bunsen-brenner og reagenser som du finner i stativ på benken: gentianafiolett, jod-jodkalium, etanol og safranin.
For å betrakte preparatet trenger du et mikroskop med 100x immersjonslinse, det står i skapet under benken. Du trenger olje til å ha mellom objekt og linse, rengjøringsvæske og linsepapir, som du finner du i skuffen.

Prinsipp
Både Gram-positive (blå) og Gram-negative (røde) bakterier tar opp gentianafiolett som er en blåfiolett fargevæske. 
Ved å tilsette jodjod-kalium dannes det et kompleks som ikke lar seg løse opp og vaskes ut med sprit hos de Gram-positive bakteriene, mens dette komplekset løses og vaskes ut med sprit hos de Gram-negative bakteriene.
Ved å tilsette det røde fargestoffet, safranin,blir de Gram-negative bakteriene farget røde(rød-rosa), mens hos de Gram-positive bakteriene legger rødfargen seg oppå den blå slik at bakteriene blir blåfiolette.

Framgangsmåte
For å spare tid har vi delt ut utstrykspreparater av pusset. 
En dråpe puss er strøket ut over på objektglasset, 
Det er lufttørket ved romtemperatur og deretter fiksert ved at det er ført med "smørsiden" ned, raskt gjennom den øvre del av gassflammen 3-4 ganger. På denne måten fikseres preparatet til glassflaten og det er ikke lenger smittefarlig.
Du kan derfor gå rett på fargeprosedyren.
 I skuffen finner du en klype som kan anvendes til å holde preparatet under farging.
Hold deg over vasken

Fargeprosedyre

1.	Drypp på gentianafiolett-oppløsning slik at preparatet blir godt dekket og la det     
      ligge på i 60 sekunder. Hell av fargen.

2.	Drypp på noen dråper av jod-jodkalium-oppløsningen. Hell av og drypp igjen på jod-jodkalium-oppløsning som skal virke i 60 sekunder .Hell av.

3.   Etanol-avfargingsvæske helles på. Vipp litt på objektglasset og tilsett nye dråper     
      med etanol som får virke til preparatet ikke avgir særlig mye farge ( ca. 30 sek.).

4.	Etanolen skylles vekk med safranin.

5.	Drypp på ny safranin og la det virke i 30 sekunder.

6.	Skyll forsiktig med vann og tørk preparatet ved å legge det mellom to filtrerpapir.
Skyll vasken med vann (bruk slangen) slik at mesteparten av fargen fjernes.

7.   Deponér en dråpe immersjonsolje på preparatet og mikroskopér med 100X 
      objektiv.

8.	Rens 100X objektivet ved å bruke rensevæske og linsepapir når du er ferdig med å          mikroskopere.

Resultat av direkte mikroskopi……………………………………………………….

Spørsmål
1.	Var det nødvendig å starte med et antibakterielt middel?
2.	Bør resultatet av direkte mikroskopi føre til annet valg av antimikrobielt middel?

Dyrkning av puss på faste medier
Faste medier til dyrkning av bakterier og sopp framstilles ved tilsetning av 0,5-2 % agar som er et polysakkarid (agar-agar) som er utvunnet av en alge. Dette polysakkaridet smelter ved 100C, men stivner først ved 45C.

Dere har fått utlevert 3 faste medier:

a)	Blodagarmedium eller blodskål (rød) hvor svært mange bakterier, både Gram-negative og Gram-positive mikrober vokser.

b)  Laktoseskål med bromtymolblått som indikator (grønn) hvor spesielt mange Gram-    
     negative mikrober vokser godt. Bromtymolblått slår om fra blått ved alkalisk til
     gult ved sur reaksjon.

b)	Mannitol-saltagarskål med fenolrødt som indikator (rosa) inneholder en høy                       
      saltmengde som mange mikrober ikke liker, men som blant annet stafylokokker   
      kan vokse på. Fenolrødt slår om fra rødt ved alkalisk til gult ved sur reaksjon.

Start med å merke de 3 skålene. Legg dem med bunnen opp og skriv med tusjpenn (ligger i skuffen) plassnummer, navn, dato og hvor materialet kommer fra.

Tenn gassflammen. (NB! Gasskranen åpnes ved at kranen først trykkes ned og så i nedtrykket tilstand vris. De røde feltene kommer tydeligere fram. Den stenges ved motsatt manøver. Ikke bruk makt). 
Den bakteriologiske øsen steriliseres ved at den glødes i øvre del av gassflammen. Den avkjøles ved å holdes en kort periode i luften eller ved å stikke ned i periferien av agaren. 
Ta korken av pussrøret og flambér kanten av røret. Øsen dyppes i pusset og pusset som fester seg på øsen deponeres på overflaten av blodskålen. 
Spre materialet utover med øsen, brenn av på nytt og spre videre med fortynningsteknikk slik at vi kan få tak i enkeltkolonier ( se velagt illustrasjon neste side). 
På samme måte sår du ut pusset på laktoseskålen og på mannitol-saltagarskålen. 
La skålene stå på benken. De vil bli samlet inn og satt til inkubering ved 37C natten over. Skålene skal settes med bunnen opp for at kondensen ikke skal renne ned på agaroverflaten.                                                                                                                                                                                                                                                                                 

Praktisk oppgave nr. 2

Undersøkelse av koagulasereaksjon hos stafylokokker.

I denne oppgaven skal 2 og 2 studenter arbeide sammen.

Den viktigste sykdomsfremkallende stafylokokken, Staphylococcus aureus (den gule stafylokokken) produseres enzymet koagulase. Denne egenskapen har betydning for stafylokokkens evne til å framkalle sykdom (virulensfaktor).  Koagulasen omdanner fibrinogen til fibrin, slik at plasma koagulerer. Dette lar seg påvise i laboratoriet.

Dere har fått utlevert 1 rør med kanin-plasma og en bakteriekultur på blodskål merket stafylokokk. Bruk den steriliserte øsen og skrap med deg rikelig med materiale fra agaroverflaten. Materialet slemmes opp (blandes) i plasmarøret.  Merk rørene med plassnummer. Det blir samlet inn og settes til inkubering.
Skålen du tok materialet fra, hjemmes til neste kursdag.

Praktisk oppgave nr. 3

Isolasjon av normalflora ved dyrkning av prøve fra egen hud/negler

Det er utdelt vattpinne, blodagarskål og mannitol-saltagarskål
Med vattpinnen gnir du godt langs kanten mellom negl og fingertupp. 
Det oppsamlede materialet overføres til skålen ved å gni vattpinnen i et fem-krone-stort område i periferien av skålen. Så videre ut med steril øse med fortynningsteknikk slik at vi kan oppnå vekst av enkeltkolonier.

Merk skålene med plassnummer, navn, dato og hvor materialet kommer fra.
Skålene blir samlet inn og satt til inkubering ved 37C natten over.

Arbeidsplan for 2. kursdag.

Normalflora, sårinfeksjoner og stafylokokker.

Tidsramme
30 min.   Innledning i kurssalen
60 min.   Praktisk arbeid. Resultat av dyrkning og resistensbestemmelse av puss fra 
                abscess. Avlesning av hud/neglprøver.
15 min.   Hjørnesamling. Oppsummering.

Oppgave nr. 1.

Resultat av dyrkning og resistensbestemmelse av puss fra abscess.

Ta først for deg blodskålen. Hvor mange forskjellige kolonityper mener du at du ser? Studér særlig områder med adskilte, ikke sammenflytende kolonier. Blodskålen er et relativt rikt medium og svært mange av de vanligste, både Gram-positive og Gram-negative mikrober vokser på denne skålen. De andre to skålene er mer selektive slik at bare enkelte bakterieslekter klarer å vokse på dem.

Ved å samarbeide i grupper, kan dere få laget Gram-preparater fra alle tre skålene. Lag ett preparat fra hver av de to skålene, laktoseagar-skål og mannitol-saltagar-skål og ett preparat fra hver av de kolonitypene du ser på blodskålen. Merk preparatene, skriv med blyant på skrivefeltet på objektglasset.

NB!  Lag samtidig preparatet som hører til oppgave nr. 3.

De mikroskopiske preparatene lages ved at du først legger en liten vanndråpe på objektglasset så tar du materiale fra én koloni av den typen du ønsker å undersøke, deretter blander du dette sammen ved hjelp av øsen.
Preparatet lufttørkes og flammefikseres før Gram-fargingen

Mens de mikroskopiske preparatene tørker, beskriver dere hvordan de forskjellige koloniene på blodskålen ser ut.
* Hvor mange millimeter er kolonien i diameter?
* Hvordan er formen (flat,hvelvet,konisk,sentral forhøyning eller sentral "navle",etc.)?
* Hvordan er begrensningen (rund,takket,spredende,etc.)?
* Er overflaten glatt eller ru?
* Hvordan er fargen (fargeløs/klar,gjennomskinnelig,hvit,gul etc.)?
*Hvordan er konsistensen (pastaaktig,slimete,tørr,brokket)? Test ut med øsen.
* Forandrer kolonien mediet? På blodskålen ser vi etter hemolyse, som dels kan ses som en oppklaringssone rundt og/eller under kolonien, eller som en grønnlig forandring av mediet rundt og/eller under kolonien.
* Hvordan lukter bakteriene?

Husk å flammefiksere det tørre preparatet før du starter fargingen. Se framgangsmåte og fargeprosedyre s. 2 i program for 1. kursdag. 
Bruk oljeimmersjonslinse 100X. Med et okular 10X blir totalforstørrelsen 1000X.

Beskriv bakteriene i de mikroskopiske preparatene og notér resultatet i tabellen nedenfor.

*  Farge: er bakteriene Gram-positive (blå) eller Gram-negative (røde)?
*  Form:  er det staver eller kokker?
*  Anordning:  ligger bakteriene i kjeder eller hauger? Enkeltvis eller parvis?

Notér også hvordan bakterieveksten påvirker indikatoren i laktoseagarskålen og i mannitol-saltagarskålen.
Sammenlign og diskutér resultatet på de 3 skålene.

* Hva forteller dette deg om bakterienes egenskaper?
* Hva forteller det deg om mediene som er brukt?

Resultat

                                antall kolonityper   Gram-egenskaper     Form (kokk,stav)

Blodagar                    ……………….      …………………      …………………

Laktoseagar 	           ……………….      …………………       …………………

Mannitol-saltagar       ………………       ………………...        …………………

*  Hvilke kolonityper tror du hører sammen?
    Hvordan ser mikrobene som vokser på laktoseagar ut på blodagar?
    Hvordan ser mikrobene som vokser på mannitol-saltagar ut på blodagar?
*  Hvilke mikrober kan vokse på en salt-agar?
*  Har mikrobene spaltet laktosen eller mannitolen i agaren?

Betydningen av de mikrobiologiske funnene diskuteres i lys av sykehistorien.

*  Hvordan tror du bakterier kan havne i et operasjonssår?

Resistensbestemmele

På hver benk er det lagt ut to sett agarskåler med resistensbestemmelse for bakterier fra pusset. Den ene er merket isolat 1 (bakterien som vokste på laktoseagar) og den andre er merket isolat 2 (bakterien som vokste på mannitol-saltagar). Det er også utdelt en skål hvor det er undersøkt på penicillinaseproduksjon for isolat 2.

Ved resistensbestemmelse blir bakterien først sådd ut på en skål og deretter blir det lagt på lapper med antibiotika. Hver lapp er merket med bokstaver tilsvarende det antibiotikum som lappen inneholder. Den sone av veksthemning som oppstår rundt de enkelte lappene, kan brukes til en klassifisering av stammens følsomhet for ulike antibiotika. Gruppe 1 = følsom, gruppe 2 = moderat følsom, gruppe 3 = lite følsom og  4 = resistent. Resistensmønsteret registreres ved å måle hemningssonens diameter

Følgende klassifisering brukes for de enkelte midlene
                                                                       Følsomhetsgruppe
                                                          1                    2               3                 4
Benzylpenicillin (PG)              > 23 mm    22-10 mm     9-7 mm        < 7 mm   
Chloramphenicol (CL)             > 32 mm     31-24 mm      utgår           < 24 mm  
Gentamicin (GM)                    > 22 mm      21-18 mm      utgår          < 18 mm
Cefalotin (CE)                         > 27 mm      26-17 mm    16-10 mm    < 10 mm

Notér resistensresultatet nedenfor, skriv ned følsomheltsgruppe.

                                                        Isolat 1                                  Isolat 2

Benzylpenicillin (PG)             ……………………..     ……………………..
Chloramphenicol (CL)            ……………………..     ……………………..
Gentamicin (GM)                    ……………………..     ……………………..
Cefalotin(CE)                          ……………………..     ……………………..

* Viser resistensbestemmelsen av de isolerte bakteriene at antibiotikavalget var riktig?

For å kunne bedømme om penicillin (eller andre betalaktamantibiotika) kan brukes, er det nødvendig å supplere resistensundersøkelse med undersøkelse av om bakterien produserer enzymer som inaktiverer midlet. Den skålen som dere har fått utlevert inneholder penicillin samt en indikator (fenolrødt) som slår om til gult når det dannes sure forbindelser. Dette skjer ved spalting av betalaktamringen i penicillin. Ved å deponere en rikelig mengde mikrober i et punkt på skålen kan denne reaksjonen fås fram (acidometrisk undersøkelse). 
Danner isolat 2 penicillinase?

Oppgave nr. 2

Avlesning av koagulasereaksjon og observasjon av andre egenskaper hos stafylokokker.

Koagulasereaksjonen som dere utførte på forrige kursdag skal nå avleses.

Koagulase-positive isolater klassifiseres som Staphylococcus aureus. De øvrige arter innen slekten Staphylococcus kalles ofte bare koagulase-negative stafylokokker.

Ta fram blodskålen, merket stafylokokk, fra forrige kursdag.
*  Kan dere påvise hemolyse?

Oppgave nr. 3

Avlesning av dyrkningsprøver fra egen hud/negler.

*  Studér bakteriekoloniene som vokser på blodagarskålen.
*  Vokser det noe på mannitol-saltagarskålen?
*  Spaltes mannitol? (Indikatoren i mediet slår om fra rød til gul).

Velg ut en av de koloniene som dominerer på blodagarskålen og lag et mikroskopisk preparat samtidig som du lager preparatene fra kulturene fra pusset.
Synes du det mikroskopiske bildet minner om det du så da du undersøkte bakteriene fra pusset?

I hjørnesamlingen til slutt skal vi gjennomgå og kommentere resultatene fra de tre oppgavene.

Arbeidsregler for å unngå laboratorieinfeksjoner.

*   Det skal aldri spises, drikkes eller røykes i laboratoriet. Dette gjelder også       
      tyggegummi, pastiller, snus etc. Ta aldri blyanter, etiketter eller lignende materiale 
      i munnen.

*   Hyppig håndvask er vesentlig for å forebygge infeksjon. Dersom du søler
      infeksiøst materiale på hendene, må hendene vaskes godt med såpe fra          
     dispenseren. 
     Du skal alltid vaske hendene før du går fra laboratoriet.
     Arbeidshansker anvendes vanligvis ikke, kun dersom du har et åpent sår på    
      hendene eller jobber med blodprodukter.

*   Ved søl av infeksiøst materiale på benker og gulv eller lignende er det nødvendig
      med såkalt flekkdesinfeksjon. Kontakt en av  instruktørene.

*   På benkene er det oppstilt plastbeholdere til avfall. De skal benyttes til infeksiøse
     "småting" (sprøytesisser, pipetter og lignende) og til skarpt, skjærende avfall
     (objektglass).
     Annet smitteførende avfall, som for eksempel dyrkningsskåler/rør vil bli samlet inn 
     av instruktørene og destruert i autoklav før det sendes ut i vanlig søppel eller
     rengjøres for gjenbruk.
     Annet avfall, som ikke er infisert, for eksempel papirhåndkler og lignende kastes i
     papirkurver. 

*   Avislesing, strikking og lignende aktiviteter skal ikke forekomme i laboratoriet.

*    Kulturer må ikke fjernes fra laboratoriet.

*    Mobiltelefonen skal slås av

Andre regler

*   Øser steriliseres i gassflammen slik at tråden er rødglødende. Dette gjøres både før   
     og etter bruk.

*   Bunsenbrenneren skal settes på sparebluss når den ikke brukes. Når flammen stilles
     om fra sparebluss til full flamme, skal dette gjøres med en rask bevegelse, ellers vil
     flammen lett slå ned i bunnen av brenneren. Alle brennere skal slukkes helt når
     kursdagen er slutt.

*   Kontollér at mikroskopets objektbord og linser er rene før mikroskopet settes bort
     for dagen.

Program kursdag 3 i 3. semester.

           Patogenese og diagnostikk av virusinfeksjoner

Tidsramme
30 min.	Innledning.
30 min.	Hjørneseminar i kurssalen. Gjennomgang av sykehistoriene.
		Omtale av cellekultur og cytopatogen effekt.
		Diskusjon av hurtigdiagnostikk ved luftveisinfeksjoner.
45 min.	Praktisk kursarbeide.

Læremål
Influensa virus: virus og infeksjon, struktur som grunnlag for antigen ”shift” og ”drift”, epidemiologi, komplikasjoner etter influensa.
 Herpesvirusgruppens basale egenskaper, infeksjon og sykdom, forstå begrepene, primærinfeksjon – latens og reaktivering. 
Dyrkning av virus som diagnostisk metode. Virusmultiplikasjon og cytopatogen effekt.
 Påvisning av virusantigen ved immunologiske metoder: enzymmerkede antistoffer.

Bakgrunnsstoff
Influensavirus.
Respiratorisk syncytialvirus (RSV).
Herpes simplex virus (HSV).

Sykehistorie 1
Sår hals og feber. Nasofaryngeal skyllevæske og halspenselprøve sendes til mikrobiologisk laboratorium.

Pasienten er en 15 år gammel pike. Hun ble undersøkt av lege etter 5 dager med feber hodepine, hoste, nedsatt appetitt, kvalme og oppkast. Hun klaget også over smerter i hele kroppen. Hun ble etterhvert noe andpusten og fikk noe vondt i halsen. Ved undersøkelsen var temperaturen 39.C, hun var dehydrert. Ved auskultasjon (lytte med stetoskop) hørtes normale respirasjonslyder. Noe røde og hovne tonsiller. Nasofarynks-skyllevæske sendes til virologisk undersøkelse. Det tas også halspensel til bakteriologisk undersøkelse (se praktisk arbeid).

Spørsmål
1.	Hva er den mest sannsynlige etiologi? Hvilke differensialdiagnoser bør en tenke på?
2.	Hvordan vil du sende prøvene til mikrobiologisk laboratorium?
3.	Hvilke muligheter har vi til å forebygge infeksjon med dette virus?
4.   Finnes det behandlingstilbud mot dette virus?

Praktisk arbeid til sykehistorie 1
Halspenselprøve er tatt til bakteriologisk undersøkelse. Den står i et rør på plassen din, merket pasient  1. Du skal så den ut på en blodskål. Merk skålen "pasientprøve 1", dato og plassnummer.
Deponer materialet ved å stryke penslen utover et 1 kr.stort område, spre det godt utover 1/3 av skålen med en sterilisert, bakteriologisk øse, så videre med enkeltkoloniteknikk som du lærte på kursdag 1. Skålen inkuberes i 35C over natten.

Sykehistorie 2
Luftveisinfeksjon. Påvisning av virusantigen i nasofaryngeal skyllevæske.

Pasienten er en 4 mndr gammel gutt, som ble innlagt barneavdelingen idag. For to dager siden ble han “forkjølet” med rennende nese, moderat feber (38,5 o C) og utilpass. Dagen etter ble han undersøkt av barnelege, fordi han hadde pustevansker, feber og tett i nesen. Ved vanlig undersøkelse fant barnelegen symptomer som tydet på mulig lungebetennelse eller bronkiolitt og la pasienten inn på sykehus. Rtg pulm viste diffus infiltrat i nedre delen av lungene. Pasienten er dårlig og trenger oxygentilførsel. Nasofaryngeal skyllevæske sendes til virologisk undersøkelse. Barneavdelingen er overfylt og det er meget viktig å foreta en rask vurdering hvorvidt pasienten bør isoleres for ikke å smitte sine medpasienter

Praktisk arbeid til sykehistorie 2
Studentene samarbeider i grupper på 3 og 4. 
Direkte påvisning av RS-virus i celler ved immunhistokjemi.
Det er utdelt preparater: celler, fiksert med aceton og eksponert for antistoffer mot RS-antigen ved en immunohistokjemisk metode som gir brun farve der cellene inneholder antigen og reagerer med de spesifikke antistoffer. Preparatene er i tillegg farvet med hematoksilin som farver kjernene i cellen blå. Kontrollpreparater uten virus blir farvet bare med dette.
Ikke kast peparatet.

Sykehistorie 3
Infeksjonssykdom ledsaget av blemmer i munnen. Påvisning av virus i cellekultur.

Camilla er 4 år. I går ettermiddag virket hun varm og utilpass, og moren målte temperaturen til 39.4. Camilla klaget over smerter i munn og hals. Situasjonen ble noe verre i løpet av natten, tross Paracetamol, og neste morgen måtte hun oppsøke lege. Det ble påvist rødt og hovent tannkjøtt og enkelte mindre sår rundt i hele munnen. Sårene så ut som drueklaser med små blemmer som sprekker. Det luktet vondt av munnen.  Legen fant også noe forstørrede og palpasjonsømme lymfeknuter. Temperaturen var da 39.2C. 

Spørsmål
1.	Hvilke mikrober kan gi et slikt sykdomsbilde?
2.	Hvordan går du frem for å stille en etiologisk diagnose ( prøvetagning, forsendelse og påvisning av agens)?
3.	Hvordan kan man identifisere virus som gir cytopatogen effekt (CPE) i cellekultur?
4.	Finnes det mulighet for spesifikk behandling av virusinfeksjon?
5.	Hvordan er prognosen?

Praktisk arbeid til sykehistorie 3 
Studentene arbeider i grupper på 3 eller 4.

Fiksert og farget preparat.
Det er utdelt preparater: celler, fiksert med aceton og farget med en immunohistokjemisk metode som gir en brun fargetone i cytoplasma på HSV-2 infiserte celler. Preparatene er bakgrunnsfarget med hematoxylin, som farger inn cellekjernen.
Ikke kast preparatene.

Mikroskopi av cellekulturer.
Ytterst på hver benk er det satt opp to mikroskoper ferdig innstilt for å se på celleculturene.
Veroceller er inokulert med prøvemateriale fra pasientens sår. Se etter cytopatogen effekt og sammenlign med ikke inokulerte Veroceller.
Cellekulturene mikroskoperes med lav forstørrelse (5 – 10 x objektiv).

Sykehistorie 3 b

Mange år senere blir Camilla (som er blitt en voksen kvinne) syk igjen. Sykdommen begynner med ukarakteristisk feber, og influensa-liknende symptomer. Noen dager senere får hun intens hodepine og vanskeligheter med å konsentrere seg. Gradvis blir hun tiltagende apatisk, får talevansker og en intens rar luktfølelse.
Hun blir innlagt på sykehus hvor hun blir undersøkt med tanke på sykdom i sentralnervesystemet. Spinalvæsken er klar med 70 celler, hovedsakelig mononukleære, normalt sukker, lett forhøyet protein konsentrasjon. MR og EEG begge tyder på en mulig affeksjon i frontalregionen.
På grunnlag av disse funn mistenker man at hun har encefalitt.

Spørsmål
1.	Hvilke aktuelle agens bør man tenke på?
2.	Hvordan går du frem for å stille en etiologisk diagnose?
3.	Hvilke behandlingstilbud har man ved en herpes-encefalitt? 

Praktisk  arbeid til sykehistorie 3 b
PCR undersøkelse.
Det er utdelt bilder av PCR undersøkelse på HSV. 
Hvordan vil du tolke resultatene fra de undersøkelsene avbildet her?
På bilde er det beskrevet hva som er applisert i brønnene på gelen.

Program kursdag 4 i 3. semester

Luftveisinfeksjoner, streptokokker og gjærsopp (Candida)

Tidsramme
30 min.  Innledning.  Normalflora i luftveiene. Bakterielle luftveisinfeksjoner.      
               Pneumonier. Virulens. Bakteremi. Endokarditt. Gjærsopp. 
20 min.  Hjørnesamling. Gjennomgang av sykehistoriene. Demonstrasjon av 
               prøvetaking  av nese og hals. Antigentest for gr. A streptokokker.
               Hemolyse.
55 min.  Praktisk kursarbeid.

Læremål
Studentene skal tilegne seg kunnskaper om normalfloraen i luftveiene og de viktigste sykdomsfremkallende mikrobene. Bakteriemi og endokarditt omtales. Studentene skal gjøre rede for virulensfaktorer som cytolysiner og kapselsubstans.
Studentene skal utføre immunologisk hurtigtest for påvisning av mikrobeantigen (Streptococcus pyogenes, streptokokk gruppe A polysakkarid).
Studentene skal kunne gjøre rede for gjærsoppinfeksjoner i munnhule og svelg.

Bakgrunnsstoff
Om normalflora i luftveiene.
Streptokokker: inndeling, identifisering, virulensfaktorer, sykdommer.
Om gjærsopp. Gjærsoppinfeksjoner i munnhulen.

Sykehistorie 1
Sår hals og feber.

Pasienten er en 15 år gammel pike som har vondt i halsen og feber. Dette er den samme pasienten som du ble kjent med på kursdag 3. Legen finner nå kraftig rubor og hevelse av halsslimhinnen og pusspropper i tonsillene. På halsen finnes  hovne glandler i begge kjevevinkler. Legen stiller diagnosen akutt tonsilitt (angina tonsillaris). Det blir tatt halspenselprøve til streptokokkantigentest (hurtigtest). Reultatet av halspenselprøven som ble sendt til bakteriologisk dyrkning foreligger (se praktisk arbeid).

Spørsmål
1.  Hvilke årsaker ville du tenke på til denne tilstanden?
2.  Hva ville du foreta deg for å få vite mer om årsaken til dette sykdomsbildet?
3.  Vil du gi antibiotika for denne tilstanden?

Praktisk kursarbeid til sykehistorie 1
Gruppearbeid. Benken deles i tre grupper.
*  Lag Gram‑preparater  fra skålene slik at alle får sett preparater fra alle kulturene.
    Lag Gram-preparatet fra kulturen til pasienten i sykehistorie 2 samtidig.
. Mens preparatene tørker kan man gå videre med dagens oppgaver.

*  Fra allmennpraksis kan du sende prøve til bakteriologisk dyrkning.
Denne prøven, halspenselen, sådde du ut på kursdag 3. Det viser seg at det er renkultur av en bakterie på skålen. Skålen er merket "pasientprøve1". Du skal nå, i samarbeid med din gruppe på benken,  identifisere denne bakterien nærmere. Til hjelp i dette arbeidet har dere fått utlevert 4 mikrober sådd ut på hver sin blodskål: Streptococcus pyogenes (også kalt gruppe A streptokokker),  Streptococcus pneumoniae (pneumokokk), en mukoid og en ikke-mukoid variant og en ”grønn” streptokokk. Grønne streptokokker eller viridans streptokokker er en samlebetegnelse på apatogene, alfa-hemolytiske streptokokker. Sammenlign de ulike kulturene med hensyn på koloniutseende og hemolysesone.

Hvilke er alfa‑hemolytiske og hvilke er beta‑hemolytiske? 
Er koloniene kuppelformede eller flate med nedsunket midtparti? 
Ser du på koloniene noen tegn til kapseldannelse? 

*  I allmennpraksis kan du gjøre streptokokkantigentest.
Det er delt ut et testkit på hver benk. Benken deles i to grupper. Hver gruppe skal utføre streptokokkantigentest. Det er utlevert en halsprøve fra pasienten til hver gruppe, den er merket ”pasientprøve 1”.
Følg utleverte bruksanvisning.

Registrering av resultat:
                                                 Hemolyse                                                                     
S. pyogenes                                ...........
“pasientprøve” 		       	 ...........
S. pneumoniae
mukoid                                      ………
ikke-mukoid			 ...........
”Grønn” streptokokk       	 ........... 

Har dere observert kjededannelse i noen av preparatene?

Spørsmål
4.  Hvilken art tror du pasientisolatet kan være ut i fra hemolyse og koloniform?
5.  Når ville du ha startet en eventuell antibakteriell behandling?

Sykehistorie 2  
Pasient med hvitlig belegg i munnhulen.
 
En 82 år gammel mann oppsøker deg på kontoret og klager over svie og brenning i munnhulen og noen ganger blødninger i munnen. Ved undersøkelse finner du at han har tannproteser i over- og underkjeve. Etter at disse er fjernet finner du, mest uttalt i overkjeven, røde (injiserte) slimhinner med flekkvis hvitt belegg.
	
Spørsmål
1.  Hva tror du pasientens aktuelle plager skyldes? 
2.  Hvilke undersøkelser vil du gjøre for å verifisere dine mistanker?
3.  Hvilken behandling vil du tilby?

Praktisk arbeid til sykehistorie 2:
*  Prøve tatt fra pasientens hvite belegg ble sendt til et mikrobiologisk laboratorium  til dyrkning. Pr. gruppe er det utdelt en skål, Sabouraud soppmedium, merket pasient 2, som viser veksten etter 2 dager. 
Inspiserer koloniene. Har skålen en spesiell lukt? 

*  Lag våtpreparat (slem opp materiale fra skålen i litt vann på objektglass og legg på dekkglass, dette preparatet må ikke tørke). Våtpreparatet skal inspiseres med tørrlinse  40 x.

*  Lag Grampreparat. 
Beskriv det du ser i preparatene.
 
*  Det er utdelt preparat, 1 pr.benk,(Gramfarget), tatt direkte fra pasientens belegg i munnhulen. Beskriv det du ser og sammenlign med våtpreparatet tatt fra dyrkningsskålene.
 
*   Inspiser Nickersons soppmedium (kommersielt tilgjengelig soppmedium som kan     
	benyttes i praksis) som er inkubert på kontor i almenpraksis.
Penselprøve er tatt direkte fra pasientens belegg i munnhulen og strøket ut over agarflatene. Brune kolonier indikerer at det er oppvekst av Candida albicans.

Hurtig test for påvisning av gruppe A Streptokokker (GAS) i almenpraksis.

Testen påviser gruppespesifikt antigen (polysakkarid) som finnes i streptokokkens cellevegg. De beta-hemolytiske streptokokkene inndeles etter typen av polysakkarid i gruppene A, B, C, F og G (Lancefields gruppeinndeling). 

Det spesifikke gruppe A antigenet fra Streptococcus pyogenes  på prøvepenselen blir ekstrahert fra bakteriens cellevegg ved hjelp avsyre og lut som er i reagensene A, B og C. Når denne løsningen plasseres på og trekker igjennom membranen i testputen vil gruppe A antigenet binde seg til spesifikke gruppe A antistoffer som er festet til membranen. Deretter tilsettes reagensene 1 og 2. Reagens 1 inneholder antistoff dekkede liposomer med rosa fargestoff. Disse antistoffene vil feste seg til eventuelt streptokokkantigen  på membranen og et rosa triangel kommer tilsyne som uttrykk for positiv test. Hvis antigen ikke er tilstede vil et rosa minustegn (-) bli synlig. 
Testen har innebygde kontroller. Det rosa minustegnet er den interne positive kontrollen og viser at reagensene 1 og 2 fungerer og er tilsatt i riktig rekkefølge. Kommer dette minustegnet ikke fram er ikke testen akseptabel. Membranbakgrunnen fungerer som negativ internkontroll og skal være hvit/lysrosa for at testen skal godkjennes.				
Utførelse av testen:
													                                                                    1. Plasser et plastrør i det lille stativet på benken og tilsett 3 dråper Reagens A(natriumnitritt)

				2. Tilsett 3 dråper Reagens B 
				(sitronsyre).
								Løsningen i røret blir gul.
		Plasser halsprøvepenselen i røret 
		straks. (Den er utlevert i et sterilt
		rør merket “pasientprøve”)
Reagens A og B er løsninger for å ekstrahere streptokokkantigenet fra celleveggen.
Bland godt og la penselen stå røret ved romtemperatur i 1 min.

3. Hold prøvepenselens skaft mot rørets kant og tilsett 5 dråper av Reagens C (buffret lut).
								Bland godt. Væsken skal bli rød.

Kryst ut væsken fra penselen ved å rulle den mot rørets indre vegg. Kast penselen. Sett en “topp” på røret (ligger i en pose i esken).
Hell hele innholdet i røret over i en Qtest TriPak brønn. La væsken
								absorbere.			
		Streptokokkagtigenet binder seg          		            til spesifikke antistoffer i testputen

4. Bland Reagens 1(liposomer med antistoffer mot gruppe A polysakkarid) ved å snu flasken noen ganger. Tilsett 3 dråper i testbrønnen. La væsken absorbere.
								Liposomer med antistoffer binder 
								seg til antigenet som har festet seg
								på testputen.

5. Tilsett 3 dråper Reagens 2 (buffret skyllevæske). La væsken absorbere – den vasker bort ikke 
								bundet lipososom med antistoff og
								ved pos. reaksjon kommer det 
                                                                                        fram en trekant svarende til 
                                                                                        bindingen av streptokokkantigenet.

Avlesning

Avles testen umiddelbart. Fargen avtar med tiden.

Positivt resultat:					Negativt resultat:
det vises et tydelig rosa triangel		hvis det vises et tydelig rosa 
i testbrønnen. Bakgrunnen bør			minustegn (-) i testbrønnen. 
være hvit/lysrosa.					Bakgrunnen bør være hvit/lysrosa.

Program kursdag 5 i 3. semester

Infeksjonsimmunologi
Serologisk diagnostikk

Tidsramme
30 min.  Innledende forelesning.
25 min.  Hjørnesamling.   Sykehistoriene. ELISA. Vaksinering.
50 min.  Praktisk kursarbeid.  Vaksinasjon.

Læremål
Forstå betydningen av spesifikt og uspesifikt infeksjonsforsvar ved utvalgte infeksjoner.
Immunitet etter infeksjoner.
Prinsipper for infeksjonsserologisk diagnostikk
Kunne utføre enkel test for påvisning av antistoffer.

Bakgrunnsstoff
Streptokokker.
Rubella.
Diagnostikk og prøvetagning.

Sykehistorie 1

Pasienten er den 15 år gammel piken du kjenner fra kursdag 3 og 4. Hun forteller at hun for 4 uker siden fikk behandling for en halsinfeksjon, penicillinkur over 7 dager. De siste 14 dagene har hun følt seg tiltagende slapp. Grunnen til at hun oppsøker deg på nytt er at hun synes urinen var mørk på farge og grumset. Dette har hun aldri opplevd før.

Spørsmål 
1.  Gir symptomene mistanke om noen bestemt infeksjonssykdom?
2.  Hvilke undersøkelser vil du foreta for å bekrefte/avkrefte dine mistanker?
3.  Hvilke råd vil du gi pasienten?
4.  Må noen tiltak treffes overfor pasientens omgivelser?

Praktisk arbeid til sykehistorie 1
Demonstrasjon av AST reaksjon i pasientserum.
Hver benk deles i to eller tre grupper. En av studentene i hver gruppe utfører testen. 
Bruk hansker.
Etter bruk kastes hanskene i kartong for smitteavfall, ikke stapp dem ned i de gule boksene.
Serumprøve fra pasienten foreligger ferdig fortynnet i 2 rør, i stativ på hver benk, 
De er merket -pas.1 titer 200- og -pas.1 titer 400-.
ASL Slidex kit er utlevert på hver benk.

Kittet ASL Slidex inneholder:
Testkort
Positivt kontrollserum
Negativt kontrollserum
Latexsuspensjon
Rørepinner

Prosedyre

Viktig opplysning før du starter.
Innholdet i de to testeskene må ikke brukes om hverandre. Det har vist seg at plasten i rørepinnene påvirker resultatet.

1.	Deponer en dråpe fra pasientserane i hver sin sirkel på testkortet. Bruk pasteurpipette.
2.	I to andre sirkler deponeres henholdsvis positivt og negativt kontrollserum.
3.	Rist forsiktig opp latexsuspensjonen og tilsett en dråpe til hvert serum.
4.	Bland latexsuspensjon og serum med en rørepinne. Skift for hver sirkel.
5.	Vipp kortet fram og tilbake. Registrer i hvilke sirkler du kan se korndannelse (agglutinasjon).
Avlesning:
Hvis det er agglutinasjon i positiv kontroll og ikke i negativ kontroll, er oppsettet gyldig
Hvis det er agglutinasjon i første serumfortynning men ikke i andre er titeret 200.
Hvis der er agglutinasjon i begge, er titeret  > 400.

Sykehistorie 2

En gravid kvinne, som hadde siste menstruasjon for 11 uker siden, oppsøker deg på legekontoret. Hun ble syk for et par dager siden. Etter en dag med feber og halsvondt, fikk hun et småprikket utslett som begynte i ansiktet og bredte seg til kroppen. Pasienten vet at hun er vaksinert mot meslinger, ellers er hun usikker på sin vaksinasjonsstatus.

Spørsmål
1.  Vurdering av serologisk diagnostikk. Hvilket antistoff leter vi etter?
2.  Hvorledes er den patogenetiske mekanismen for denne tilstanden?
3.  Har den relasjon til noen spesiell type av det infeksiøse agens?
4.  Kan tilstanden behandles?
5.  Hva er prognosen?
6.  Er sykdommen smittsom? Må/bør eventuelle familiemedlemmer behandles?

Praktisk kursarbeid til sykehistorie 2
Påvisning av rubellaantistoffer i serum.
Hver benk deles i to eller tre grupper. En student i gruppen utfører testen. Bruk hansker.
Etter bruk, kastes hanskene i kartong for smitteavfall, ikke stapp dem ned i de gule boksene.

Serum merket pas. 2 skal brukes i testen. Et Rubalexkit er plassert på hver  benk.

Studentene skal også teste egne sera. Ikke rist på rørene. Det er serumet på toppen dere skal bruke.

Rubalexkittet inneholder:
Testplater
Rørepinner/pipetter
Positiv kontroll
Negativ kontroll
Latexsuspensjon

Prosedyre

Viktig opplysning før du starter.
Innholdet i de utleverte testeskene må ikke brukes om hverandre. Det har vist seg at plasten i rørepinnene påvirker resultatet. Den andre enden av pipetten er rørepinne.

1.	Deponer en dråpe av positiv og negativ kontroll i hver sin sirkel på testkortet.
2.	I en tredje sirkel plasserer du en dråpe fra pasientens serum.
3.	I de øvrige sirklene kan dere teste studentenes egne sera.
      Bruk ny pipette for hvert serum.
4.	Rist forsiktig opp latexsuspensjonen og tilsett en latexdråpe til hver serumdråpe.
5.	Bland serum og latexsuspensjon med en rørepinne slik at blandingen dekker sirkelfeltet.
6.	Vipp testkortet fram og tilbake.

Avlesning:
Agglutinasjon som vises etter 3 min. angir positivt resultat, dvs. tilstedeværelse av antistoffer mot rubellavirus.

Demonstrasjon av EIA testsystem som alternativ måte for påvisning av rubellaantistoffer.

Det er utlevert et brett med resultat av EIA-test for påvisning av IgG- og IgM-antistoffer mot rubellavirus.

Serum fra to pasienter er testet.

Rad 1      IgG        Rad 6      IgM

   A           O            A            O         Blank (for å nullstille fotometeret)
   B  	    O           B            O           Positiv kontroll
   C           O           C             O           Negativ kontroll
   D           O           D             O           Serum fra pasient A som er pasienten i sykehistorie 2
   E           O            E             O           Serum fra pasient B

Brunfarge angir positivt utslag. Fargens intensitet vil til en viss grad være korrelert til mengde antistoff som er tilstede.

Prinsipp for påvisning av antistoffer ved en "enzym linked immunsorbent 
assay " EIA eller ELISA.

Proteinantigen fra en mikroorganisme er bundet til veggene i et plastbrett med 96 brønner.
Pasientserum tilsettes en brønn.
Hvis pasientens serum inneholder antistoffer mot antigenet, skjer det en binding.
Ved å vaske med en buffer vil antistoffer som ikke har bundet seg, bli fjernet.

For å visualisere denne bindingen, tilsettes først et antistoff mot IgG eller IgM (eller IgA) som er koblet til et enzym (for eksempel pepperrotperoksydase).
Ved så på ny å vaske med en buffer vil anti antistoff-enzymkomplekset, som ikke har bundet seg, bli fjernet.
Deretter tilsettes et substrat for enzymet. Det er fargeløst, men blir spaltet til en farget forbindelse av enzymet.

Dersom pasientens serum inneholder antistoffer mot antignet i brønnen (virus, bakterie), får vi en positiv fargereaksjon. Dersom pasientens serum ikke inneholder antistoffer, skjer det ingen fargereaksjon i brønnen.

Vaksinering
Studentene vaksinerer hverandre med vaksine mot difteri og tetanus.

TETANUS  (STIVKRAMPE)  Utdrag fra Veiledning om vaksinasjon 1996

Innledning
Tetanus skyldes toksin fra tetanusbakterien. Bakteriesporer kommer inn i kroppen gjennom forurenset sår, spirer og vokser ved anaerobe betingelser i det skadede vev. Under ugunstige forhold kan toksinproduksjonen komme i gang i løpet av seks timer. Inkubasjonstiden for sykdom er vanligvis 3 dager - 3 uker og kan være lengre. Inkubasjonstiden er kortere og sykdomsforløpet mer dramatisk jo høyere smittedosen er og jo bedre betingelsene for toksinproduksjon er.

Sykdommen starter typisk med muskelrigiditet i kjevene, så i nakke og rygg og etter hvert smertefulle spasmer. Selv med optimal sykehusbehandling er dødeligheten høy

Smittestoffet finnes utbredt i naturen (øvre del av jordsmonnet). I Norge er ikke tetanus noe tallmessig stort problem. Årlig meldes 1-4 tetanustilfeller. Oftest rammes uvaksinerte personer. Tetanus forekommer hyppigere i strøk med varmere klima.

Neonatal tetanus er i verdensmålestokk en viktig dødsårsak hos nyfødte. Navlestedet er inngangsport for smittestoffet. Neonatal tetanus forekommer ikke i Norge.

Tetanusvaksine har vært tilgjengelig her i landet fra ca. 1945 og ble innført i barnevaksinasjonsprogrammet fra 1952.

Vaksinen
Vaksinen består av renset tetanustoksoid (tetanustoksin som er gjort ugiftig ved formalinbehandling) adsorbert til et aluminiumsalt: Tetanustoksoid alene er lite immunogent, men det blir meget immunogent etter adsorbsjon. Mange vaksineprodukter er tilsatt thiomersal som konserveringsmiddel (se pakningsvedlegg).

Det finnes ren tetanusvaksine, men som hovedregel anbefales vaksinasjon med difteri/tetanusvaksine (DT) eller difteri/tetanus/kikhostevaksine (DTP).

Etter basisvaksinasjonen med 3 doser gitt med riktig intervall er ca. 100% av de vaksinerte beskyttet i 10 år. To vaksinedoser med minst 4 ukers intervall gir beskyttelse i minst 1 år.

Personer som er basisvaksinert, vil få beskyttelse etter en enkelt boosterdose selv om det er gått flere tiår siden forrige vaksinedose.

Indikasjoner
•	spedbarn i henhold til det anbefalte vaksinasjonsprogrammet (DTP-vaksine).
•	i forbindelse med behandling av sår med risiko for tetanussmitte, avhengig av vaksinasjonsstatus (vanligvis DT-vaksine).
•	ved utenlandsreiser, avhengig av reisemål og tidligere vaksinasjonsstatus (vanligvis DT-vaksine).

Kontraindikasjoner
•	alvorlig reaksjon på tidligere vaksinedose(for eksempel straksallergisk reaksjon). Det kan likevel være aktuelt å gi vaksinen under utvidet beredskap.
•	Akutt infeksjonssykdom med feber over 38ºC.
Gravide bør vaksineres hvis det er indisert   
I praksis forekommer ikke absolutte kontraindikasjoner fordi sykdommen det vaksineres mot er livstruende.

Bivirkninger 
•	lokalreaksjoner i form av rødhet og hevelse av varierende størrelse på injeksjonsstedet. Kan opptre i løpet av første uke og vare i dager til uker. Store lokalreaksjoner kan til forveksling likne erysipelas, men CRP er normal eller bare lett forhøyet. De krever ingen behandling. Lokalreaksjoner forekommer hyppigere ved revaksinasjon enn ved primærvaksinasjon og hyppigere hvis vaksinen ikke settes dypt nok.
•	steril abscess på injeksjonsstedet. Abscess opptrer uker til måneder etter injeksjon. Forekomsten blir høyere ved dårlig risting av vaksinen før bruk, subkutan injeksjon, og ved bruk av vaksine som har vært frosset.Steril abscess krever ingen behandling. Risikoenfor varig arr øker hvis abscessen incideres,
•	generelle bivirkninger som hodepine, tretthet, søvnighet, sykdomsfølelse eller feber.

Anbefalt vaksinasjonsregime
Basisvaksinasjon består av tre doser.

I vaksinasjonsprogrammet gis DTP-vaksine ved 3, 5 og 10 måneders alder.

Større barn og voksne: til basisvaksinering av barn over 2 år og voksne brukes vanligvis kombinert difteri/tetanusvaksine. Anbefalt intervall mellom 1. og 2. dose er 4-8 uker, mellom 2. og 3. dose 6-12 måneder.

Hvis intervallet mellom 2. og 3. dose er under 5-6 måneder, varer beskyttelsen i de fleste tilfelle bare få år. For å ha vedvarende beskyttelse anbefales det i slike tilfelle å revaksinere etter 1-4 år. Selv om intervallene overskrider det som anbefales, skal alle gitte doser telles (ingen maksimumsintervall).

Ved sårbehandling: se tabell nedenfor.

Det anbefales ikke å revaksinere oftere enn hvert 10. år annet enn i forbindelse med sårskader. Se tabell 

Immunglobulin
Spesifikt humant tetanus immunglobulin (HTIg) er laget av plasma fra immuniserte givere med høyt nivå av spesifikke antistoffer mot tetanus.

Indikasjoner
•	tegn på tetanus sykdom
•	forurenset sår der det går mer enn 6 timer før sårrevisjon, eller der såret ikke lar seg revidere fullstendig hos personer som er eller antas å være mangelfullt vaksinert.
Behandlende lege har ansvar for indikasjonsstillingen.

Kontraindikasjoner
I praksis ingen, siden preparatet gis på vital indikasjon.

Bivirkninger
•	smerter på injeksjonsstedet
•	feber og uvelfølelse
Preparatet inneholder små mengder IgA og kan gi reaksjoner hos personer med IgA-mangel

Administrering av immunglobulin
Ved skader
Humant tetanus immunglobulin (HTIg) settes så snart som mulig, gjerne før sårrevisjon. Anbefalt dosering er angitt i pakningsvedlegget. Dosen kan fordeles på flere injeksjonssteder hvis det er ønskelig. Immunglobulin settes intramuskulært.
Tetanusvaksine gis samtidig, men på et annet injeksjonssted.

Ved etablert sykdom/mistanke om tetanus
Humant tetanus immunglobulin (HTIg) inngår i sykehusbehandlingen. Dosering er angitt i pakningsvedlegget.

BRUK AV VAKSINE OG IMMUNGLOBULIN VED SÅRSKADER.

Det er avgjørende om såret oppfattes som rent eller forurenset. Rent sår er sår som ikke er synlig forurenset eller er renset og revidert innen 6 timer etter at skaden inntraff. Forurenset og dødt vev er fjernet. Urent sår er et synlig forurenset sår eller et sår med dødt vev, som ikke er revidert i løpet av de første 6 timene etter at skaden inntraff. I tvilstilfelle, for eksempel ved dyp stikkskade eller skade i sterk forurenset miljø, bør såret vurderes som urent.

Sårtype          Vaksinasjonsstatus                        Siste vaksinedose                          Immunisering
______________________________________________________________________________________
Rent sår        Basisvaksine (3 eller 4                  Mindre enn 10 år siden                     Ingen
                     doser, korrekt intervall)
                                                                            Mer enn 10 år siden                         Vaksine x 1
______________________________________________________________________________________
Rent sår         Delvis basisvaksinert                    Mindre enn 12 måneder                   Ingen
                       (siste dose mangler)                     siden  

                                                                             Ellers                                               Vaksine x 1
______________________________________________________________________________________
Rent sår          Fått én vaksinedose                                                                               Vaksine x 2 med
                                                                                                                                     6 mndr. intervall
______________________________________________________________________________________
Rent sår          Ikke vaksinert eller                                                                              Full basisvaksinering
                       ukjent vaksinasjonsstatus
______________________________________________________________________________________
Urent sår        Basisvaksinert (3 eller 4               Mindre enn 5 år siden                     Ingen
                       doser, korrekt intervall
                                                                             Mer enn 5 år siden                          Vaksine x 1
______________________________________________________________________________________
Urent sår        Delvis basisvaksinert                   Mindre enn 12 mndr. siden              Ingen
                       (siste dose mangler)
                                                                            Mindre enn 5 år siden                      Vaksine x 1
                                                                            Mer enn 5 år siden                            HTIg + vaksine x 1
______________________________________________________________________________________
Urent sår        Fått én vaksinedose                                                                              HTIg + vaksine x 2
                                                                                                                                     6 mndr. intervall
______________________________________________________________________________________
Urent sår        Ikke vaksinert eller                                                                               HTIg + full
                       Ukjent vaksinasjonsstatus                                                                     basisvaksinering
______________________________________________________________________________________

Barn som er i gang med spedbarnvaksinasjonsprogramme, bør ved sårskade fortrinnsvis få DTP-vaksine slik at dosen kan inngå i barnets vaksinasjonsprogram. Til større barn og voksne brukes DT-vaksine hvis ikke spesielle grunner gjør det uforsvarlig å gi difterikomponenten. Det er unødvendig å gi vaksine til personer som har påbegynt basisvaksinasjon og har fått to doser for mindre enn 12 mndr. siden. Hvis det er mer enn 6 mndr. siden siste dose, kan det immidlertid være hensiktsmessig å benytte anledningen til å følge opp basisvaksinasjonen med en boosterdose, selv om det ikke er strengt nødvendig av hensyn til sårskaden.

Program kursdag 6 i 3. semester

Anaerobiose og sporedannelse

Tidsramme
30 min.   Innledning. Anaerobe infeksjoner: diagnostikk, patogenese, terapi og profylakse.
20 min.   Hjørnesamling.
45 min.   Praktisk arbeid. Studere bakteriekulturer på blodskål. Mikroskopere. Besvare 
                spørsmål.                                                                                                                                                                                                                                                                                                        
10 min.   Hjørnesamling. Gjennomgang   av spørsmålene.

Læremål
Studentene skal kunne forklare sporedannelse.
Studentene skal kunne redegjøre for diagnostikk, patogenese, terapi og profylakse ved anaerobe infeksjoner.

Bakgrunnsstoff
Anaerobe bakterier og infeksjoner.
Sporedannere.

Vi tar for oss tre sykehistorier 1, 2, 3.

Benken er delt i tre grupper, hver gruppe har fått utdelt:

Blodskål 1      Blodskål 2      Blodskål 3       Referansepreparater:   
                       Preparat 2       Preparat 3       Bacteroides fragilis
                                                                      Clostridium tetani
					           Actinomyces israelii

Sykehistorie 1

En tolv år gammel jente er innlagt og operert fordi blindtarmen var gangrenøs. Operasjonssåret ble sydd igjen og lukket. Etter tre dager begynte det å sive sekret fra såret.

Spørsmål
1.	Hva er det som indikerer at dette kan være en anaerob infeksjon?
2.	Hva er tentativ klinisk diagnose?
3.	Hva slags prøve bør tas?

Praktisk arbeid til sykehistorie 1

Undersøk oppvekst av bakterier på utlevert blodskål merket 1.
Hvordan vokser bakteriene på blodskålen?

Du skal selv lage Gram-preparat fra kulturen på blodskålen.
Mikroskoper preparatet.
Hva karakteriserer de aktuelle cellene i Gram-preparatet?

Dette preparatet skal sammenlignes med referansepreparatene.
De er merket:
Bacteroides fragilis
Clostridium tetani
Actinomyces israelii

Spørsmål etter avlesning
4.	Hvilken anaerob bakterie kan dette være?
5.	Hva slags toksin danner denne bakterien?
6.	Hvilken behandling er aktuell?
7.	Hvilke antibiotika kan benyttes?
8.	Burde noe vært gjort annerledes i den primære behandlingen av pasienten?

Sykehistorie 2

En 57 år gammel mann tråkket på en rusten spiker som gikk gjennom joggeskoen og inn i høyre stortå for så å komme ut ved siden av neglen.
Pasienten søkte lege 10 timer etter skaden. Såret ble forsøkt renset, og det ble startet med penicillintabletter 0,66 g x 4 pr. døgn.
 Tetanusvaksine ble gitt i den hensikt å få "booster"-respons.
Fem dager senere ble pasienten syk. Han fikk vansker med å tygge og ble dessuten stiv i rygg og nakke.

Spørsmål
1.	Hvilke holdepunkter er det for å mistenke anaerob infeksjon?
2.	Hva slags prøve bør tas?
3.	Hva er tentativ klinisk diagnose?
4.	

Praktisk arbeid til sykehistorie 2

Undersøk oppvekst av bakterier på utlevert blodskål merket 2.
Hvordan vokser bakteriene på blodskålen?

Mikroskoper Gram-farget preparat merket 2, det er materiale fra kulturen på blodskålen.
Hva karakteriserer de aktuelle cellene i Gram-preparatet?

Dette preparatet skal sammenlignes med referansepreparatene.
De er merket:
Bacteroides fragilis
Clostridium tetani
Actinomyces israelii
Spørsmål etter avlesning
5.	Hvilken bakterie kan dette være?
6.	Hvilken behandling er aktuell?
7.	Hvilke antibiotika kan være aktuelle?
8.	Hva er årsaken til symptomene?
9.	Hvordan kan sykdommen forebygges?

Sykehistorie 3

Du blir oppsøkt av en tyve år gammel mann med fluktuasjon og vev av trehård konsistens i kinnet.
Fistler i området tømmer ut puss. Pusset inneholder gule korn.

Spørsmål
1.	Hva er det som indikerer at dette kan være en anaerob infeksjon?
2.	Hva slags prøve bør tas?
3.	Hva er tentativ klinisk diagnose?

Praktisk arbeid til sykehistorie 3

Undersøk oppvekst av bakterier på utlevert blodskål merket 3.
Hvordan vokser bakteriene på blodskålen?

Mikroskoper Gram-farget preparat merket 3, det er materiale fra kulturen på blodskålen.
Hva karakteriserer de aktuelle cellene i Gram-preparatet?

Dette preparatet skal sammenlignes med referansepreparatene.
De er merket:
Bacteroides fragilis
Clostridium tetani
Actinomyces israelii

Spørsmål etter avlesning
4.	Er dette en sporedanner?
5.	Bakterien ble tidligere kalt strålesopp. Hvilken bakterie er det?
6.	Hvilken behandling er aktuell?
7.	Ville dere ha gitt antibiotika?
8.	Hvilke antibiotika kan være aktuelle?
9.	Hvor lenge ville dere ha gitt antibiotika?

Program kursdag 7 i 3. semester

Antibiose

Tidsramme
45 min.   Innledning.
15 min.   Hjørnesamling.
25 min.   Praktisk arbeid.
20 min.   Hjørnesamling.

Læremål
Ha oversikt over antibiotika og deres virkningsmekanismer.
Kjenne mekanismer for resistens (genetiske og biokjemisk/fysiologiske).
Forstå konsekvensene av antibiotika-inaktiverende enzymer. 
Kjenne til  resistens-undersøkelse ved agar-diffusjonsmetoden og kjenne metodens feilkilder.
Kunne tolke resultatene av resistensbestemmelse.

Bakgrunnsstoff
Antibakterielle midler.
Resistensbestemmelse.
Genetikk.

Sykehistorie 1

Kvinne, 35 år, hadde fra morgenen av hatt dysuri (smerter ved vannlatningen) og pollakisuri (hyppig vannlatning). Temperaturen ble målt til 37.5 oC. Urinen luktet annerledes enn vanlig. Hun var ikke bankeøm over nyrelosjene. Hun hadde tilsvarende symptomer tidligere, sist for 2 år siden. Da ble hun symptomfri etter trimetoprim i 3 dager.

Spørsmål
1.  Hva er sannsynlig diagnose? Differensialdiagnoser?
2.  Årsaksammenheng?
3.  Hvilke prøver bør tas for mikrobiologiske undersøkelser?
4.  Hvordan bør disse prøvene tas og forsendes?

Mikroskopi viste pyuri og bakteriologisk dyrkning at der var mer enn 100.000 Escherichia coli pr. ml urin. 

Hvilke mikrober er de vanligste etiologiske agens (årsakene) ved akutte, ukompliserte
urinveisinfeksjoner hos kvinner?

Spørsmål etter avlesning 
5.  Hvilket antibiotikum vil du velge til kvinnen? Hvilken betydning vil eventuell graviditet ha 
     for antibiotikavalget?
6.  Hvilken betydning har svar på resistensbestemmelse ved akutte urinveisinfeksjoner?
     Nevn de viktigste grunnene til terapisvikt.
7.  Hva er mekanismen for resistens mot de angitte antibiotika?

Sykehistorie 2

En 58 år gammel mann ble utskrevet dagen etter en hånd-operasjon. Tredje dagen hadde han betydelig tegn på infeksjon i hånden (tumor (hevelse), rubor (rødhet), dolor (smerte), functio lesae (nedsatt funksjon) og puss. Han oppsøkte legevakten. Der fant man kliniske tegn på abscess. Legen tok to prøver for mikrobiologisk undersøkelse. Det ble strøket en pensel over sårranden (der det var puss) og det ble samlet puss fra abscesshulen da den ble incidert. 

Spørsmål
1.  Hvordan skal prøvene transporteres til laboratoriet?
2. Fra pusset i sårranden vokste koagulase-negative stafylokokker, grønne streptokokker,       difteroider, Escherichia coli og Staphylococcus aureus. Fra abscess-pusset vokste Staphylococcus aureus.
Hvilken tolkning vil du gi funnet?								

Spørsmål etter avlesning 
3.  Danner stammen beta-laktamase?
4.  Er den følsom for beta-laktamase-resistente penicilliner?
5.  Hvilke midler er stammen følsom for?
6.  Behøver pasienten behandling?
7.  Når vil man velge lokalbehandling og når er systemiske antibiotika aktuelle?
8.	Hvilket systemisk middel vil du i så fall velge?  Drøft valget i forhold til pasient-parametre
      som allergi og epidemiologi.

Praktisk arbeid til sykehistorie 1 og 2

Utlevert
Agarskål til resistensbestemmelse.
Saltvann til å fortynne bakteriekultur.
Kulturer fra sykehistoriene 1 og 2
Utvokset resistensskål.
Skål for å påvise beta-laktamase.

Resistensbestemmelse etter agar-diffusjonsmetoden. 
På hver benk jobber to og to sammen om å  sette opp en resistensskål.
To bakterie-kulturer (1 og 2) er utlevert. 
1 = Escherichia coli.
2 = Staphylococcus aureus.

Hver gruppe med to studenter løser oppgaven sammen. De har fått 1 PDM-skål (agarskål), 2 rør med resistensbuljong, filtrerpapirlapper impregnert med hvert sitt antibiotikum og kultur 1 eller 2.

Utsæd av bakterier for resistensbestemmelse ved agar-diffusjon.
Merk skålens bunn med plassnummer og 1 eller 2.
Vi skal lage en tynn bakteriesuspensjon.
	Bruk pasteurpipette. Gummismokk settes på den tykkeste enden og spissen på pipetten brekkes av og pipetten flamberes. Med avkjølt pipette berøres ca. 10 kolonier på blodskålen med pipette-spissen som deretter føres ned i et av saltvannsrørene. Ved å blåse væske ut og inn av pipetten 8 - 10 ganger, oppnås en homogen bakteriesuspensjon. Til slutt tømmes pipetten så godt som mulig for væske.. Væskefilmen inne i pipetten inneholder da rikelig med bakterier. 
	Før pipetten over i det andre saltvannsrøret og blås væsken ut og inn 4 – 5 ganger. Tøm pipetten. 
	Suspensjonen fra det andre røret helles ut på resistensskålen og fordeles på hele agaroverflaten. Sug opp overskytende væske med pipetten. Skålen settes til tørk med lokket av til den er tørr (noen minutter).
	Som siste ledd i prosedyren legges resistenslapper på den tørre agarskålen (med pinsett). Med et varsomt press mot lappene sørger man for god kontakt med agaren, slik at det antibakterielle stoffet får optimale betingelser for å starte diffusjonen utover i agaren. 
	Skålene står til prediffusjon ved romtemperatur i 30 minutter før de settes i inkubator ved 35 oC over natten.

Valg av antibiotikalapper

Sykehistorie 1 (Escherichia coli) 
AM 	Ampicillin
CI	Ciprofloxacin
MM	Mecillinam
NI	Nitrofurantoin
TR	Trimethoprim
TS	Trimethoprim-sulfametoksazole 

Sykehistorie 2 (Staphylococcus aureus)
PG	Benzylpenicillin
CE	Cefalotin
EM	Erythromycin
FU	Fucidic acid
CM	Clindamycin
NC	Netilmicin
VA	Vancomycin

Lappene legges jevnt fordelt utover overflaten.

Avlesning og tolkning av resistensbestemmelse

Arbeidsprosedyre
Det er utlevert ferdige skåler til avlesning, tre sett pr. benk.

Registrering av hemningssone-diametere og tolkning/oversettelse til følsomhetsgrupper
	Etter inkubasjon ved 35 oC over natten vil bakteriene ha vokst på overflaten av agaren der konsentrasjonen av de ulike antibiotika (på et gitt tidspunkt) ligger under det nivå som kreves for å hemme veksten (minste hemmende konsentrasjon = MIC). Rundt lapper med hemmende antibiotika oppstår hemningssoner. De er i normalt sirkulære, rundt antibiotikadepotet. Diameteren skal måles i mm og noteres. Hemningssonens størrelse angir hvor følsom bakterien er overfor det antibakterielle midlet lappen inneholder. Jo større hemningssonens diameter er, desto mer følsom er bakterien. Dersom hemningssoner er under en viss størrelse, er bakterien resistent (følsomhetsgrad 4). Dersom hemningssonen er over en bestemt diameter, er bakterien fullt følsom (følsomhetsgrad 1). Tabellen nedenfor viser korrelasjonen mellom mm hemningssone og hvilke MIC-områder som tilsvarer de ulike gradene av følsomhet. Med tabellen kan man tolke mm hemningssone som stammens MIC, følsomhetsgrad. Før opp hva de enkelte mm hemningssone-diametere tilsvarer i følsomhetsgrad. 

Gruppe 1	Følsom. Terapeutisk effekt kan forventes ved vanlig dosering.
Gruppe 2	Moderat følsom. Terapeutisk effekt kan forventes ved høy dosering.
Gruppe 3	Relativt resistent. Terapeutisk effekt kan forventes ved vanlig dosering for infeksjoner i organer der midlet konsentreres i særlig høy grad, f.eks. i urinveier og     galleveier.
Gruppe 4	Resistent. Terapeutisk effekt er usannsynlig uansett dosering.

Millimetermål

Korrelasjon mellom mm og MIC
__________________________________________________________________________________
Kode	Antibiotikum		Sonegrenser			Brytningspunkter, MIC
			for de 4 følsomhetsgrupper		for de 4 følsomhetsgrupper
                                                    mm                                                       mg/l
________________________________________________________________________________________________                                                                                                                                                                                                                                            1             2 	  3         4		1	  2	  3	  4
__________________________________________________________________________________   			              >        < -  >        <  - >       <		<           > - <        > - <         >
 __________________________________________________________________________________   

AM 	Ampicillin	22       21 - 16    15 - Ø     Ø		2	2 - 8	8   - 64	   64
PG	Benzylpenicillin	24       23 - 11    Utgår*     10		1	1 - 32	Utgår       32
CE	Cefalotin	28       27 - 18    17 - 12    11		2	2 - 16	16 - 64     64	
CI	Ciprofloxacin	28       27 - 23    22 - 19    18		0,25	0,25-1 	1 -   4       4
EM	Erythromycin	26       25 - 20    Utgår       19		1	1 - 4	Utgår        4
FU	Fucidic acid	33       Utgår       Utgår      32		1	Utgår	Utgår        1
CM	Clindamycin	25       24 - 19     Utgår      18		1	1 - 4	Utgår        4
MM	Mecillinam	25       24 - 20    19 - 10     9		1	 1 - 4	4 - 64        64
NC	Netilmicin	23       22 - 19    Utgår       18		2	2 - 8	Utgår        8 
NI	Nitrofurantoin	19       Utgår      Utgår       18		32	Utgår	Utgår        32
TR	Trimethoprim	22       Utgår       21 - 17    16		2	Utgår    2 - 8	    8
TS	Trimethoprim-
          sulfametoksazole	20           #	  #	19		2	Utgår    2 - 32	    32
VA	Vancomycin	20      19 - 17     Utgår       16		4	4 - 16	Utgår        16	
Ø	=	Ingen sone rundt lappen. 
*	=	Utgår betyr at vedkommende preparat ikke kan brukes til vedkommende indikasjon,
f.eks. brukes ikke benzylpenicillin ved urinveisinfeksjoner. Derfor er ikke
		følsomhetsgruppe 3 anført for PG.
# 	=	Ikke fastsatt pga. metodens usikkerhet ved dette kombinasjonspreparatet.
									
Resultater (les av m.m. hemningssone, finn følsomhetsgruppe og MIC)
_________________________________________________________________________________ 
Antibiotika			   Sonediameter	      Følsomhetsgruppe   MIC
 				     (mm)		                                      (mg/l)
__________________________________________________________________________________

Sykehistorie 1 (Escherichia coli) 
AM 	Ampicillin		......................		..............	      ..............
CI	Ciprofloxacin		......................		..............	      ..............
MM	Mecillinam		......................		..............	      ..............
NI	Nitrofurantoin		......................		..............	      ..............
TR	Trimetoprim		......................		..............	      ..............
TS	Trimethoprim-
                sulfametoksazole	......................		..............	      ..............

Sykehistorie 2 (Staphylococcus aureus)
PG	Benzylpenicillin		......................		..............	      ..............
CE	Cefalotin		......................		..............	      ..............
EM	Erythromycin		......................		..............	      ..............
FU	Fucidic acid		......................		..............	      ..............
CM	Clindamycin		......................		..............	      ..............
NC	Netilmicin		......................		..............	      ..............
VA	Vancomycin		......................		..............	      ..............
__________________________________________________________________________________

D. Beta-laktamaser
 
1. Beta-laktamase hos gule stafylokokker

Utlevert: Beta-laktamase-skål.

Vi skal også påvise beta-laktamase hos Staphyloccocus aureus.

	Stafylokokker kan danne beta-laktamaser (hos stafylokokker tidligere kalt penicillinaser, fordi  enzymene har smalt substrat-spektrum). 
	For å påvise stafylokokkers penicillin-inaktiverende enzymer bruker vi en agar som inneholder benzylpenicillin og en pH-fargeindikator (fenolrødt). Rød farge viser alkalisk og gul farge betyr sur pH. Beta-laktamase fører til at beta-laktamringen spaltes slik at det dannes en karboksylgruppe og pH synker. Rikelig materiale fra veksten av stammen som skal undersøkes overføres til agaren. Én stamme med og én uten beta-laktamase-dannelse brukes i praksis gjerne som henholdsvis positiv og negativ kontroll. 
	Produksjon av beta-laktamase vises ved gul farge.
	Man kan også med en mindre nøyaktig metode ha mistanke om stafylokokker danner ved å observere resistensskålen. Stammer med produksjon av beta-laktamase danner fete kolonier helt inn til grensen for hemningssonen, mens stammer uten beta-laktamase gjerne viser større hemningssoner og viser en mer gradvis overgang mellom full hemming og full, uhemmet vekst.
	Stafylokokker som danner beta-laktamaser kan fortsatt behandles med penicilliner. Det er en fordel pga. penicillinenes lave toksisitet. De beta-laktamase-stabile penicillinene (som bare er brukbare mot stafylokokker) er kloksacillin, dikloksacillin, meticillin og oksacillin. Bakterier utvikler alltid, med en viss sannsynlighet, resistens mot antibiotika, stafylokokker også overfor de beta-laktamase-stabile penicillinene.  Av historiske grunner betegnes slike stammer ofte som meticillin-resistente, (MRSA) men meticillin brukes ikke lenger terapeutisk. 
	
[Resten av dette avsnitt er bakgrunnsstoff og gjelder ikke oppgaver i dette kurset: I praksis bruker vi utsæd på to agar-medier med henholdsvis 1 mg/L og 4 mg/L oksacillin for å bestemme følsomhet overfor oksacillin. Vekst på begge skålene viser resistens mot oksacillin. Vekst på skålen med 1 mg/L men ikke på skålen med 4 mg/L indikerer at stammen har intermediær følsomhet. Dersom stafylokokken ikke vokser på noen av de to skålene med oksacillin (men på kontroll-skålen uten antibiotikum) er stammen fullt følsom for penicilliner. Kryssresistens gjør at stafylokokker som er resistente overfor 4 mg/L oksacillin også er å betrakte som klinisk resistente mot andre beta-laktamantibiotika (penicilliner, cefalosporiner, penemer), uansett om der kan være hemningssoner rundt resistenslappene.]

2. Induserbare beta-laktamaser

	Antibiotika-inaktiverende (og andre) enzymer kan produseres bestandig, eller de kan dannes bare på betingelse av at et aktuelt substrat er til stede. De første kalles konstitutive, de andre induserbare. De siste dannes av enkelte bestemte Gram-negative stavbakterier som Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa,  Citrobacter, Morganella, Proteus og Serratia. 
	Problemet med stammer som danner induserbare beta-laktamaser er at slik produksjon bare skjer dersom et beta-laktam-antibiotikum er til stede. Det betyr at man kan få til dels store hemningssoner ved agar-diffusjonsmetoden. Derfor må man undersøke antibiotika følsomheten under spesielle laboratorie-betingelser for å kunne påvise induserbare enzymer. Fenomenet har også den konsekvens at man kan få terapisvikt med et  stoff som i rutinemetoden har oppvist hemningssoner som etter størrelsen isolert sett skulle tilsvare full følsomhet, fordi midlet blir inaktivert av induserte beta-laktamaser som bakeriene danner i store mengder straks de stimuleres av et egnet beta-laktam. Det eneste unntaket her er undertiden imipenem, fordi det er svært resistent mot de fleste (men ikke alle) beta-laktamaser.